山雨欲来风满楼，在大革命即将来临之际，敏感的蔡元培，仿佛在黎明前的黑暗中看到了曙光。他一改五四时期自由派知识分子的姿态，积极投身到革命洪流之中。
11月初，孙传芳在江西被国民革命军击败。为配合广东国民革命军的北伐，推翻直系军阀孙传芳在苏浙皖东南三省的统治，蔡元培与褚辅成、沈钧儒、黄炎培等发起组织苏浙皖三省联合会，策动三省自治运动。
11月14日，苏浙皖三省联合会在上海成立。23日，苏浙皖三省联合会在上海举行第二次委员会议，蔡元培被推举为主席。
1926年11月28日，三省联合会与上海总工会、商会总会、学联等各界400余社会团体召开“上海市民反对奉军南下”大会，蔡元培在会上登台演讲，号召上海市民组织起“人民政府”。利用各种机会，大造社会舆论策应北伐。
12月，国民党中央政.治.会.议在南昌召开，决议于浙江设立临时政.治.会.议，张静江、蔡元培、褚辅成、查良钊、沈钧儒、朱少卿等为委员，以张静江为主席。张未到前，由蔡元培代理。
对蒋介石的任命，蔡元培复信表示：“为国为党，义不容辞。”
12月19日，浙江宣布自治。
蔡元培等人策动的浙江自治，遭到了孙传芳、卢永祥等军阀势力的打压和破坏。
23日，孙传芳下令取缔苏浙皖三省联合会，通缉蔡元培、沈钧儒、褚辅成等70余人。
1927年1月，浙江省临时政.治.会.议被迫决定，转往宁波成立省政府。蔡元培匆匆赶往宁波，筹建浙江省政府。
不久，宁波被吴佩孚的部攻占，省政府再次无法成立。于是，蔡元培和马叙伦等乘渔船由浙江转移福建，于1月21日抵达福州，23日到达厦门。
2月19日，北伐军攻克杭州。第二天，蔡元培就马不停蹄地由厦门奔赴杭州。
3月1日，浙江临时政.治.会.议在杭州正式成立，蔡元培任委员，并代张静江任主席。
这个时候的蔡元培，住在杭州青年会，可以说是忙得不亦乐乎。
姜绍谟曾回忆说：求见蔡元培的人络绎不绝，许多人来要求他介绍工作，他乐于接受，当场就写介绍信，而且总是亲手写，从不假手于人。
一天晚上，已经十点多钟了，一个青年画家求见。此人带着他的画，请蔡元培介绍工作。蔡元培问明青年画家能画宣传品后，当场写信把他介绍给白崇禧的东路军指挥部。
北伐战争在人民群众的积极支持下势如破竹，不到半年就占据了江南大部分地区，迅速发展到了长江流域。这个时候，正值国民党和共.产党两党合作的蜜月期，两个党各有所长，优势互补，用大家常说的一句话是，大革命汹涌澎湃。
但是，这样的大好形势没能维持多久。
1927年3月21日，张静江自江西蒋介石行营抵达杭州，住进新新旅馆。当晚，蔡元培与邵元冲即往拜访，听取有关蒋介石的反.共清党计划。张静江向他们传达说：“介石对于与共产党分离事已具决心，南京定后，即当来宁共商应付。”
24日，蔡元培跟随张静江由杭州抵达上海，与先期抵达那里的吴稚晖、李石曾、黄郛等一起筹划反.共清党事宜。3月27日，蔡元培、吴稚晖等迁入丰林桥蒋介石总部行营，召开国民党中央监察委员会常务会议。这次会议亦被称作“预备会”。
28日，蔡元培与吴稚晖、李石曾、张静江、古应芬等召开第三次会议。蔡元培被推为会议主席。五名到会的监察委员中，除古应芬资历稍浅以外，其余四人都是民国元老。
这次会议可以说是清党的发难会议，发难人为吴稚晖。根据会议的原始记录，吴稚晖首先发言，报告“共.党谋叛情形”。
他说：“共.产党陈独秀明言二十年内实行共.产，及已入国民党之共.产党员谋叛国民党，及不利于中华民国之种种行为。”
会议付诸讨论，吴稚晖提议“纠察共.产.党人”。蔡元培表示附议，主张“取消共.产.党人在国民党之党籍”。
吴稚晖的反.共提案获得通过，决议如下：“由原提议人拟具草案，交监察委员会全体会议公决。至除名部分，俟另案办理。”
这次会议还通过了吴稚晖提议的“现在共.产.党种种行为，实危害本党及中国，此次运动应名为护党救国运动”。
4月2日，国民党中央监察委员会全体会议召开。除了蔡元培与吴稚晖、李石曾、张静江、古应芬五人之外，监察委员增加了陈果夫、李宗仁、黄绍竑三人，而实际上国民党中央监察委员共有20人，与会人员根本不过半数。蔡元培担任会议主席。
吴稚晖正式向会议提出弹劾共.产.党文告，作为蒋介石集团发动政变的法律依据和舆论准备。吴把共.产.党反对新军阀、批评辛亥革命的不彻底性、提倡向俄国革命学习等，都说成是为了实行共.产.主.义而“决定铲除国民党之步骤”，是共.产党的“逆谋”。
就是这次仅八人到会的所谓中央监察委员会全体会议，通过了吴稚晖拟具的草案，即1927年5月被列入第一号《国民政府公报》的《请查办共产党呈文》。
吴稚晖说：“今者共产党有谋逆之整备，遂喧腾其联共之口号，诬罔总理（孙.中山），挟制舆论，以图大逞。”他还说，在3月6日晚和陈独秀谈话时，他问陈，中国实行共产主义须若干年？陈独